重磅成果！ACS Catalysis：翌圣鎂孚泰生物聯(lián)合中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所實(shí)現(xiàn)LAMP核心酶分子進(jìn)化新突破

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）是一種簡單而高效的DNA擴(kuò)增檢測方法，以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、準(zhǔn)確、簡單等特點(diǎn)，在疾病診斷、轉(zhuǎn)基因食品檢測等分子POCT領(lǐng)域應(yīng)用越來越廣泛。LAMP技術(shù)核心酶—Bst DNA聚合酶的性質(zhì)，包括聚合活性、鏈置換能力和熱穩(wěn)定性，在LAMP技術(shù)的反應(yīng)速度和準(zhǔn)確性方面起著決定性的作用。

翌圣鎂孚泰生物持續(xù)專注于酶分子改造研究，依托國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題一“高性能等溫?cái)U(kuò)增核心酶與量產(chǎn)工藝開發(fā)”（課題編號：2022YFF0710101），我們與中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所（以下簡稱“蘇州醫(yī)工所”）展開了深入合作，利用熒光激活微液滴分選（FADS）技術(shù)，對Bst DNA聚合酶進(jìn)行了定向篩選，成功進(jìn)化出了耐熱Bst DNA 聚合酶。

蘇州醫(yī)工所長期致力于酶分子改造及超高通量酶篩選技術(shù)，自主搭建了FADS平臺（圖1）。包括光學(xué)系統(tǒng)、電路控制、信號采集和微流控模塊。針對微流控模塊，該團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)并制造了三種類型的芯片：液滴生成（圖1b）、微注射（圖1c）、液滴檢測與分選（圖1d)?；谝旱挝⒘骺丶夹g(shù)，該平臺能夠在單細(xì)胞水平上篩選大型突變文庫，每天的篩選通量超過1000萬個(gè)突變體。

圖1. FADS超高通量酶篩選平臺。a、該系統(tǒng)主要由光源、信號發(fā)生器、電壓放大器、數(shù)字電源、光電倍增管（PMT）、信號采集卡、高速攝像機(jī)組成。b，液滴生成芯片。c，電場觸發(fā)的皮升注射芯片。d，熒光激活的液滴分選芯片。

與此同時(shí)，翌圣鎂孚泰生物的科研人員利用自身豐富的酶應(yīng)用及改造經(jīng)驗(yàn)，設(shè)計(jì)了基于鏈置換活性篩選探針的Bst DNA聚合酶超高通量篩選方案，并在FADS平臺實(shí)現(xiàn)應(yīng)用（圖2）。通過半理性設(shè)計(jì)、隨機(jī)突變和DNA重組的方式，分別建立Bst DNA聚合酶的突變庫，并將其以單細(xì)胞的形式包裹到微液滴中。經(jīng)過三輪的篩選（圖3），成功富集到陽性突變體M2和M3。

圖2. Bst DNA聚合酶FADS分子改造示意圖。a，通過半理性設(shè)計(jì)（不同顏色代表不同的氨基酸突變）建立多位點(diǎn)飽和突變庫。b，在第一輪篩選的陽性突變體的基礎(chǔ)上，建立隨機(jī)突變庫以提高熱穩(wěn)定性（紅點(diǎn)代表上一輪篩選的優(yōu)秀突變位點(diǎn)，其他不同顏色的點(diǎn)代表其他不同氨基酸的突變）。c，對第二輪篩選中的突變體進(jìn)行DNA重組（紅點(diǎn)代表前幾輪篩選中獲得的優(yōu)秀突變位點(diǎn)）。d，經(jīng)過三輪篩選，我們成功地分離出了具有更好的熱穩(wěn)定性和鏈置換能力的突變體。e，將文庫轉(zhuǎn)化為大腸桿菌BL21（DE3）細(xì)胞。在IPTG誘導(dǎo)后，每個(gè)細(xì)胞包含各自不同的Bst DNA 聚合酶（不同的顏色代表不同的突變體）。f，當(dāng)單個(gè)細(xì)胞被反應(yīng)體系包裹時(shí)，液滴中的熒光缺失，這是由于引物上存在一個(gè)猝滅基團(tuán)。g，裂解試劑破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致Bst DNA聚合酶的釋放，用于鏈置換反應(yīng)。隨后，引物被替換，導(dǎo)致液滴發(fā)出熒光。h，在FADS分選系統(tǒng)中陽性液滴被富集。

圖3. FADS系統(tǒng)的建立和篩選過程。a，不同時(shí)間段培養(yǎng)的細(xì)胞在微反應(yīng)器中亮場和熒光圖像。b，表達(dá)WT和突變文庫的微反應(yīng)器亮場和熒光圖像（孵育30 min）。c，第1輪進(jìn)化陽性菌株的富集。d，第2輪進(jìn)化陽性菌株的富集。第3輪進(jìn)化陽性菌株的富集。

隨后，蘇州醫(yī)工所團(tuán)隊(duì)基于工程化突變體成功研制出專用LAMP試劑反應(yīng)體系（圖4）。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，該突變體在55℃恒溫條件下將特征峰出現(xiàn)時(shí)間由35分鐘提前至10分鐘以內(nèi)，且在常規(guī)溫度區(qū)間內(nèi)的反應(yīng)速率均顯著優(yōu)于進(jìn)口N*的Bst 2.0體系。突破性的是陽性突變體展現(xiàn)出70℃極端溫度的耐受性，據(jù)此聯(lián)合團(tuán)隊(duì)建立起首創(chuàng)性高溫LAMP（HT-LAMP）檢測技術(shù)，為解決傳統(tǒng)LAMP檢測中頑固性假陽性難題提供了創(chuàng)新方案。研究還創(chuàng)新性開發(fā)出基于Bst DNA 聚合酶陽性突變體的凍干型LAMP試劑，相較于野生型Bst DNA 聚合酶，突變體將試劑的貯藏穩(wěn)定性提升兩個(gè)數(shù)量級，在50℃加速儲存條件下仍能維持半年以上活性穩(wěn)定性。這些突破性進(jìn)展使Bst DNA 聚合酶突變體成功蛻變?yōu)長AMP技術(shù)領(lǐng)域中極具應(yīng)用潛力的核心酶組分。

圖4. Bst DNA聚合酶突變體在LAMP檢測中的表現(xiàn)。a，Bst DNA聚合酶突變體在不同溫度下的LAMP檢測中的表現(xiàn)。b，與NEB的Bst DNA聚合酶（綠色）相比，突變體M2（橙色）和M3（紅色）在不同溫度下對不同靶點(diǎn)的活性顯著提高。c，M2在假陽性實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)。d，M3在假陽性實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)。e，Bst DNA聚合酶突變體在50℃熱加速實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)。

最后，科研人員對突變體進(jìn)行分子機(jī)制解析，發(fā)現(xiàn)了提高鏈置換活性的新機(jī)制，提出了“疏水刀刃”的假說，為進(jìn)一步提高Bst DNA聚合酶鏈置換活性提供了理論指導(dǎo)（圖5）。

圖5. Bst DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)分析。a，顯示了Bst DNA聚合酶的亞結(jié)構(gòu)，并描述了其與模板和引物的結(jié)構(gòu)位置（PDB：3TAN）。b，N204R突變前后的結(jié)構(gòu)變化。c，I359L突變前后的結(jié)構(gòu)變化。d，F(xiàn)445I突變前后的結(jié)構(gòu)變化。e，E461K和N462K突變前后的結(jié)構(gòu)變化。f，D428K和Y429W突變前后的結(jié)構(gòu)變化。

綜上所述，聯(lián)合團(tuán)隊(duì)首次將超高通量微液滴篩選技術(shù)應(yīng)用到Bst DNA聚合酶的進(jìn)化中，成功篩選出高活性突變體，應(yīng)用到LAMP體系中，極大地縮短了LAMP反應(yīng)的出峰時(shí)間，提高了酶的熱穩(wěn)定性，確保了酶的長期穩(wěn)定保存，從而實(shí)現(xiàn)了從野生型酶到有應(yīng)用價(jià)值的商品酶的跨越，也充分展示了FADS技術(shù)在分子酶高效進(jìn)化中的巨大威力。

該研究成果以“FADS-Based Directed Evolution of a Robust Bst DNA Polymerase Adapting High-Temperature Loop-Mediated Isothermal Amplification (HT-LAMP)”為題，發(fā)表在生物催化領(lǐng)域的頂級期刊ACS Catalysis上（中科院1區(qū)TOP，影響因子11.3）。蘇州醫(yī)工所李曉、翌圣生物唐瓊衛(wèi)博士為該論文第一作者，馬富強(qiáng)研究員、尹煥才研究員和劉想博士為通訊作者，該研究得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、中國科學(xué)院青年創(chuàng)新促進(jìn)會、江蘇省社發(fā)項(xiàng)目、山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、蘇州市基礎(chǔ)研發(fā)試點(diǎn)項(xiàng)目等多個(gè)國家級、省部級項(xiàng)目的支持。

原文鏈接：https://doi.org/10.1021/acscatal.4c07614